ADN III: _{La replicación del ADN}

El síntesis del ADN

Como fue mencionado en nuestro módulo ADN II, el momento que James Watson y Francis Crick miraron su nuevo modelo de ADN, pudieron ver pistas acerca de las propiedades importantes que sabían que el ADN debe exhibir: autorreplicación. El misterio de la autorreplicación había confundido a científicos durante muchos años. Pero una cosa estaba segura: todas las células, ya sea levadura, una bacteria o célula humana debe poder copiar todos sus genes, todo su ADN. Esto se debe a que cuando una célula se divide en dos, ambas células resultantes son genéticamente idéntica una a la otra y a la célula original. El gran numero de veces de que el ADN en su cuerpo se replica (y con exactitud) es increíble.

Se comienza la vida como una simple célula, un cigoto, el resultado de un espermatozoide y un ovocito. Desde ese entonces, se ha desarrollado a un organismo con entre 10 y 100 trillones de células (>10,000,000,000,000). Y con ciertas raras excepciones, cada una de sus trillones de células tiene la misma secuencia de ADN como la tenia la célula cuando era simplemente un cigoto. ¿Cómo se lleva a cabo todo esta replicación de ADN?

Como fue mencionado en la molécula de DNA de doble hebra dio claves poderosas de cómo el ADN puede ser copiado con exactitud. Específicamente, el emparejamiento de base complementario del ADN sigue un patrón estricto que nos permite predecir con exactitud la apariencia de una hebra de ADN solo por mirar a la otra hebra complementaria. Puesto de otra manera, si alguien toma una molécula de ADN, separara las dos hebras y nos mostrara solo una hebra, nosotros podríamos exactamente enumerar la serie de nucleótidos de la hebra que hace falta.

Watson y Crick vieron esta posibilidad cuando terminaron su articulo diciendo "No se nos ha escapado de que un emparejamiento especifico que hemos postulado inmediatamente sugiere un mecanismo posible para copiar material genético". Esta posible mecanismo es llamado replicación de ADN semi-conservativa debido a que si una celular duplicara su ADN de esta manera, la hélice de ADN se separaría en dos y ambas de estas nuevas dobles hélices retendrían ADN de la hebra original (Figura 1). Mientras que este esquema tiene sentido, al principio era simplemente una suposición lógica. No fue hasta finales de la década de 1950 de que Matthew Meselson y Franklin Stahl realizo un experimento científico que mostró de que la replicación de ADN fue de hecho semi-conservativa (nuestro módulo de Meselson y Stahl estará disponible pronto).

En la década de 1950, Meselson y Stahl, Watson y Crick y muchos otros científicos exploraron las propiedades del ADN utilizando la bacteria intestinal Escherichia coli. Debido a que pocas cepas de E. coli se han encontrado como la causa de enfermedades gastrointestinales, E. coliE. coli no son dañinas y nuestro intestino grueso están llenos de esta bacteria. E. coli fue uno de los primeros "organismos modelos" utilizados rutinariamente, es decir, especie que es seleccionada para estudios extensos en un laboratorio debido a que ofrece ciertas ventajas practicas que facilitan la investigación. El E. coli, particularmente, es uno de los organismos en la tierra con mayor rapidez en crecimiento, con un tiempo de generación menor de 20 minutos en condiciones ideales. Desde antes de saber lo que es el ADN, los científicos habían notado de que la cantidad de ADN en una célula de E. coli (y en cualquiera otra célula) era el doble en comparación a antes de la división de células. La piscina de ADN en una célula se separa igualmente entre dos "células hijas" que resultan, para que ambas tengan la misma cantidad de ADN que tenia la bacteria original antes de replicarse. Debido a que todo esto sucede en E. coli durante 20 minutos, fue el organismo lógico para que seleccionaran los primeros biólogos moleculares.

Replicación de ADN in Vitro

Mientras que Meselson y Stahl y otros estaban probando los posibles modelos hipotéticos de la replicación de ADN, otros científicos se lanzaron a entender su mecanismo molecular por medio de volver a crearlo en un tubo de ensayo. Este proceso es llamado reconstitución in vitro y es comúnmente utilizado en el área de bioquímica y es una manera de simplificar un evento celular complejo de manera que suceda en aislamiento y por ende ser observado y manipulado cuando se necesite. Los científicos primeros en poder reconstituir la replicación de ADN en un tubo de ensayo fueron Arthur Kornberg y su esposa Sylvy y el equipo de investigadores que ellos dirigían. Ellos lograron esta hazaña increíble por medio de el tedioso proceso de purificación química sucesiva de diferentes proteínas y otros componentes de lotes grandes de bacteria de Escherichia coli. Al separar y purificar componentes individuales, el equipo de investigación de Kornberg llevo a cabo varios descubrimientos importante acerca de cómo ocurre la replicación de ADN.

Estos descubrimientos todos comenzaron con el desarrollo de una técnica critica importante - el ensayo de síntesis de ADN. Un ensayo o ensayo químico es una medida cuantitativa de laboratorio de un proceso biológico o químico, usualmente en un tubo de ensayo in vitro. El ensayo de síntesis de ADN es una técnica para medir la síntesis de una nueva molécula de ADN. El laboratorio de Kornberg fue el primero en desarrollar este ensayo y el mismo ensayo fue muy simple. Primero, polímeros de ADN son fácilmente separados de nucleótidos libres debido a que el ADN no es soluble en soluciones que contienen acido tricloroacético (TCA), mientras que los nucleótidos libres si lo son. Si un científico agrega TCA en una mezcla liquida de ADN y nucleótidos libres y el ADN se liberaran mientras que los nucleótidos se mantendrán disueltos en el liquido. El ADN liberado se puede fácilmente separar del liquido por medio de centrifugación.

El segundo atributo importante del ensayo de síntesis de ADN es su uso en nucleótidos etiquetados como radioactivos. Un científicos puedo agregar nucleótidos radioactivos cuando se prepara un ensayo de síntesis de ADN, y luego, si ocurrió la síntesis de ADN alguna etiqueta de radioactividad será incorporado en el ADN insoluble en TCA. Esto provee evidencia de que algunos de los nucleótidos etiquetados fueron polimerizados en una nueva molécula de ADN. Este ensayo de síntesis de ADN es muy fácil de ejecutar y así mismo es bien cuantitativo, lo cual significa que proporciona valores muy confiables y reproducibles que pueden ser utilizados para calcular cuanto ADN fue hecho y que tan rápido fue la síntesis.

Armados con este ensayo, el laboratorio Kornberg fue el primero en reportar la síntesis del ADN afuera de una célula viviente. La prensa popular de ese entonces anuncio de que Arthur Kornberg había "creado vida en un tubo de ensayo".

Claro que este no fue el caso, pero la nueva habilidad para sintetizar el ADN in vitro capturo la atención de la población general y es reconocido como el éxito mas crítico abriendo paso para la aparición de la ingeniería genética en la década de 1970 y la década de 1980. Inicialmente, la síntesis del ADN de laboratorio fue muy baja (mucho mas baja en comparación a como ocurre en una célula), y ocurrió solamente cuando extractos crudos de E. coli fueron agregado tubos de ensayo. Extractos crudos contienen todos los contenidos de las células - todas las proteínas, nucleótidos, ADN, ARN, lípidos, carbohidratos, etc. Sin embargo, el ensayo de síntesis de ADN fue un buen punto de partida de la cual Kornberg y otros pudiesen comenzar a disecar el proceso de la replicación del ADN a detalle.

El primer descubrimiento y se podría decir que es el mas importante ocurrió en 1955: el equipo de investigación de Kornberg purifico la enzima del extracto crudo que es primordialmente responsable por la síntesis de ADN - de la polimerasa del ADN. Cuando la polimerasa del ADN purificada es agregada al ensayo de síntesis de de ADN, la síntesis de ADN ocurre cientos de veces mas rápidamente en comparación a cuando no ha sido agregado. Sin embargo, la síntesis in vitro del ADN aun requiere la adición de pequeñas cantidades de extracto crudo de célula. Esto es debido a que la polimerasa de ADN no se hace por si sola - existen muchos otros factores requeridos y no todos estos fueron conocidos en ese entonces. El laboratorio de Kornberg y otros alrededor del mundo trabajaron para purificar otros componentes importantes como el extracto crudo, en la esperanza de que algún día podían hacer ADN utilizando solamente los factores necesarios y sin extracto crudo.

Algunos de estos componentes requeridos fueron obvios, mientras que otros eran inesperados. Por ejemplo, fue rápidamente descubierto de que los nucleótidos eran requeridos para la síntesis de ADN, la cual no es sorprendente debido a que era bien sabido, inclusive en la década de 1950, de que los nucleótidos eran las bases del ADN. Sin embargo, solamente los nucleótidos en la forma tri-fosfato pueden ser utilizados como ADN (Figura 2). Estudios posteriores demostraron porque esto era así, la desintegración de enlaces de fosfato terminales de alta energía de cada nucleótido contribuida a una molécula creciente de ADN proveía la energía para la reacción de la polimerización.

Otro punto importante que el laboratorio de Kornberg notó fue que la síntesis de ADN en tubo de ensayo requerían la presencia de una copia-plantilla intacta del ADN para que la polimerasa de ADN pueda hacer mas ADN. En otras palabras, hasta en un tubo de ensayo, la polimerasa de ADN no puede construir moléculas de ADN "aleatorias" por medio de la polimerización al azar de nucleótidos. Solamente puede realizar copias de moléculas de ADN que ya existen. Viéndolo de otra manera - la polimerasa de ADN es como una maquina fotocopiadora, NO como un tipo de escritor y una maquina fotocopiadora no puede imprimir de todo al menos que tenga una plantilla con que trabajar. Entonces cuando Kornberg agregó moléculas de ADN intactas purificadas al ensayo de síntesis de ADN, una vez mas la velocidad de la polimerasa de ADN incremento dramáticamente. (antes de este descubrimiento, síntesis de ADN ocurría solamente por las pocas cantidades de las plantillas de ADN presentes en el extracto crudo que es agregado a la mezcla del ensayo.)

Las dos hebras de ADN

Adicionalmente a la búsqueda para mas de los factores individuales involucrados en la replicación de ADN, el ensayo de síntesis de ADN permitió a los investigadores para estudiar las propiedades del síntesis de ADN. Mientras que los científicos alrededor del mundo comenzaron a estudiar polimerasa de ADN y la replicación de ADN, ellos sabían de que el modelo semi-conservativo de la replicación del ADN, como fue comprobado por Meselson y Stahl, requiere de que las dos plantillas originales de hebras de ADN eran separada para poder ser copiadas individualmente. Sin embargo, no se sabia como esto sucede. Los científicos habían observado de que las dos hebras de ADN son mantenidas juntas de manera apretada por los enlaces de hidrogeno entre pares base de nucleótido complementario de dos hebras. En el laboratorio, la única manera que dos hebras podrían ser separadas era calentando el ADN a temperaturas de casi punto de ebullición. Obviamente, no es probable que las células vivientes generen alto calor para poder separar las dos hebras de ADN, entonces la pregunta permaneció, ¿"Dentro de una célula viviente, que separa las dos hebras originales de ADN para que puedan ser copiadas"?

Debido a que el ADN de doble hebra es bien estable, los científicos sospecharon de que debe de haber un mecanismo elaborado para separar dos hebras. Dos grupos de investigación, incluyendo Arthur Kornberg descubrieron la respuesta a finales de la década de 1970: Una enzima que nombraron helicasa de ADN. Esta enzima es capaz de separar las dos hebras de ADN para que las dos hebras individuales puedan servir como plantillas para polimerasa de ADN, de acuerdo al modelo semi conservativo.

Sin embargo, resulta que cuando el helicasa separa una sección de ADN, no comienza al final de la molécula en el caso del ADN lineal, tampoco selecciona un lugar al azar. El "derretimiento" inicial del ADN ocurre en ubicaciones especificas, llamadas orígenes de replicación de ADN. Cada un crea un abombamiento en el ADN de doble hélice que es visible por microscopia de electrón. Estos abombamientos son llamadas "burbujas de replicación" y representan sitios de ADN síntesis (Figura 3).

Cuando una burbuja de replicación se abre y la síntesis de ADN comienza, la replicación en ambas direcciones, alejándose del origen. Una enzima de helicasa de ADN guía el camino, abriendo el ADN patrón mientras la replicación sucede. Ambas de estas regiones móviles de síntesis de ADN son referidas como "tenedores de replicación", las cuales son los sitios en los cuales de la replicación de ADN se ejecuta (Figura 4).

Los partidores de ADN

Una vez que los científicos comenzaron a enfocarse en los eventos que ocurren en los tenedores de replicación, hicieron varias observaciones interesantes que les ayudaron a darse cuenta que la síntesis de ADN era mucho mas complicada de lo que se imaginaban al principio. El primero de estos descubrimientos intrigantes fue realizado por una joven científica Japonesa llamada Tsuneko Okazaki, mientras trabajaba en su investigación Postdoctoral con Kornberg en Stanford. Okazaki notaba de que la polimerasa de ADN no puede simplemente comenzar a copiar la plantilla una vez que haya sido separada de su hebra complementaria. Algo mas es necesitado para comenzar la copia del ADN antes de que la polimerasa de ADN pueda entrar en acción. Okazaki luego descubrió que podía "persuadir" la polimerasa de ADN a realizar replicación de ADN si agregaba una pieza corta de ADN que era complementaria a parte de la plantilla de ADN (Figura 5). Debido a esta molécula corta de ADN servia para comenzar la síntesis de ADN, Kornberg los nombró "partidores".

El descubrimiento de partidores fue un gran avance debido a que ahora los científicos conocían todos los componentes cruciales que eran necesitados para llevar a cabo una reacción de síntesis de ADN eficiente in vitro. Ya no tenían la necesidad de extracto crudo de células. Además, el descubrimiento de partidores llevo a otra observación curiosa por científicos, incluyendo Tsuneko Okazaki y su esposo Reiji Okazaki, ambos entrenados por Kornberg, quienes habían regresado a Japón y formaron su propio grupo de investigación. Los Okazakis notaron de que cuando reacción de síntesis de ADN se prepara y se le agrega un partidor, la síntesis de ADN comienza en el partidor y procede en una sola dirección. Curiosamente, no observaron replicación de la región de ADN en el otro lado de partidor.

Regresando al modelo estructural del ADN construido por Watson y Crick, el equipo de investigación realizó de que la polimerización de ADN solamente ocurría a un lado del partidor, el lado de 3' y continuaba en esa dirección. Esto no era simplemente un artefacto peculiar de Síntesis de ADN in vitro. La replicación de ADN dentro de todas las células vivientes también procede solamente en una dirección - 5' a 3' (Figura 6). Esta propiedad es llamada síntesis de ADN unidireccional.

Fragmentos de Okazaki

Una vez que se realizo de que la síntesis de ADN procede en una dirección, Okazaki, Kornberg y toda la comunidad de científicos que trabajan con ADN realizaron de que esto traía un serio problema de su entendimiento de que la síntesis de ADN procede en ambas hebras de la plantilla de ADN después de que las dos hebras son separadas y habían visto como la enzima de la polimerasa de ADN siguen detrás de la helicasa de ADN, sintetizando las nuevas hebras de ADN al lado de ambas hebras de plantilla originales (el modelo semi-conservativo de replicación de ADN). ¿Pero como puede ser esto posible si la síntesis de ADN puede proceder en una sola dirección (Figura 7)?

Fue Reiji Okazaki quien primero postuló la solución a este problema. El se imagino de que la única manera de que la replicación de ADN puede ocurrir en ambas hebras del tenedor de replicación, pero todavía proceden solamente en la dirección de 5' a 3' era continua en una de las hebras, siguiendo detrás de la helicasa de ADN, pero discontinua en la otra hebra, procediendo en espacios cortos se llama fragmentos de Okazaki en honor a Reiji Okazaki, sin embargo fue el trabajo de todo el equipo de investigación de Okazaki, el equipo de investigación de Kornberg y varios otros que confirmaron la hipótesis de Okazaki en relación a replicación discontinua de ADN (Figura 8). Fue Kornberg quien acuñó los términos que llevaron hebra por hebra en cual la replicación de ADN es continua, y alentando la hebra por la hebra en la cual la síntesis ocurre en fragmentos de Okazaki cortos y discontinuos de ~300 nucleotides de ADN.

Trágicamente, Reiji Okazaki murió siete años después de su famoso descubrimiento de replicación discontinua de ADN. Nacido en Hiroshima, tenia solamente 15 años cuando la primera bomba atómica fue lanzada e irradio altamente mientras buscaba a sus padres entre los escombros. Sufrió los efectos de su enfermedad de radiación, finalmente cayendo a Leucemia a la edad de 44. Los Okazakis y los Konrbergs fueron ambos grandes ejemplos de equipos científicos de esposo y esposa (figura 9).

Siguiendo estos avances importantes, los científicos se movieron con rapidez en plantear los otros personajes principales del tenedor de replicación (Figura 10). Por ejemplo, fue descubierto por el laboratorio de Kornberg de que el partidor que es necesario para iniciar la síntesis de ADN dentro de las células esta hecho de ARN y no ADN y que esto puesto en su lugar por la enzima llamada primasa de ADN. Este ARN es eventualmente reemplazado por el ADN por una versión especializada de la polimerasa de ADN llamada polimerasa I de ADN (ADN pol I), mientras que el factor principal de la polimerasa de ADN es de hecho polimerasa II de ADN (DNA pol III).

Después, fue descubiertos de que los fragmentos de Okazaki individuales de la hebra lenta necesitan ser enlazados covalentemente juntos. La enzima que sella los fragmentos de Okazaki se llama ligasa de ADN (Figura 11). Debido a que esta enzima "sella" dos segmentos de ADN juntos, la ligasa de ADN luego se probara ser una herramienta esencial en ingeniería genética, tal y como las moléculas de ADN de diferentes fuentes son "cortadas y pegadas" para hacer nuevas combinaciones de y nuevas secuencias de ADN.

Alfred Kornberg honorado con el Premio Nobel de la Química

Para todos los descubrimientos importantes que nos llevaron a nuestro entendimiento de los eventos moleculares que se llevan a cabo en el tenedor de replicación de ADN, Alfred Kornberg fue honorado con el Premio Nobel de la Química en 1959. Durante su vida, el Dr. Kornberg fue mentor a muchos jóvenes científicos quienes fueron a tener muchos logros, incluyendo los Okazakis, cuyo trabajo pionero con la replicación discontinua de ADN llevo al descubrimiento de fragmentos de Okazaki. Otros estudiantes famosos de la llamada "Escuela de Kornberg" incluyen lideres de investigación alrededor del mundo en la academia y la industria de biotecnología. De hecho, no es sorpresa de que la industria de biotecnología empezó principalmente en el área de la bahía de San Francisco, debido a que Konberg paso la mayoría de su carrera en la Universidad de Stanford, a solo 30 millas (48 kilómetros) de San Francisco. Entre los estudiantes mas famosos de Arthur Kornberg fue su hijo, Roger Kornberg, quien dice haber "crecido en el laboratorio" viendo a su padre realizar importantes descubrimientos acerca del síntesis de ADN. Con su propio equipo de investigación, Roger estudio laboriosamente el proceso del síntesis del RNA, también llamado transcripción de genes, el cual tienen muchos paralelos a la síntesis de ADN.

Así como Arthur Kornberg se gano el Premio Nobel en 1959 por descifrar los eventos en la síntesis de ADN, su hijo Roger fue otorgado el Premio Nobel en el 2006 por una vida de investigación en la síntesis de ARN. El éxito de este dúo de padre e hijo demuestra como servir de mentor de la próxima generación de científicos esta entre el labor mas importantes que pueden realizar los científicos, una realidad enfatizada por el hecho de que la gran mayoría de investigaciones científicas se llevan a cabo en un ámbito académico e involucra a jóvenes científicos en entrenamiento como los soldados del descubrimiento.